Mecanismos de cristalização de proteínas de membrana em 'bicelles'

Scientific Reports volume 12, Número do artigo: 11109 (2022) Citar este artigo

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Apesar do progresso notável, principalmente devido ao desenvolvimento de LCP e cristalização 'bicelle', a falta de informações estruturais continua sendo um gargalo na pesquisa de proteínas de membrana (MP). Uma das principais razões é a ausência de compreensão completa do mecanismo de cristalização. Aqui apresentamos estudos de espalhamento de pequeno ângulo da evolução da matriz de cristalização "bicelle" no decurso do crescimento do cristal MP. Inicialmente, a matriz corresponde ao estado bicelle do tipo líquido. No entanto, após a adição do precipitante, a matriz de cristalização se transforma em um estado gelatinoso. Os dados sugerem que esta fase final é composta por bicamadas interconectadas em forma de fita, onde os cristais crescem. Uma pequena quantidade de fase multilamelar aparece e seu volume aumenta concomitantemente com o volume dos cristais em crescimento. Sugerimos que a fase lamelar envolve os cristais e é crítica para o crescimento do cristal, o que também é comum para a cristalização do LCP. O estudo revela mecanismos de cristalização de MP "bicelle" e apoiará o projeto racional de cristalização.

As proteínas de membrana (MPs) desempenham um papel essencial nos processos celulares vivos, como transporte de íons através da membrana, conversão de energia e transdução de sinal1,2. Um terço do genoma humano codifica proteínas de membrana. Devido ao seu papel significativo na fisiologia humana, as proteínas de membrana são alvo de cerca de 60% dos fármacos atualmente utilizados3,4. Até o momento, o método mais amplamente utilizado para obter estruturas de proteínas de alta resolução é a cristalografia de raios-X, que requer cristais de proteínas de alta qualidade. No entanto, a cristalização de proteínas de membrana continua a ser um grande desafio. Estruturas únicas de proteínas de membrana5 representam apenas ~ 1% de todas as estruturas de proteínas únicas de alta resolução disponíveis6. Um dos métodos in meso é a cristalização em mistura bicelar7,8,9,10,11. No entanto, esse método leva à elucidação de várias MPs importantes, cujo mecanismo ainda não está claro e depende apenas de tentativas e erros exaustivos. O termo "cristalização de bicelles" pode estar relacionado apenas ao estado inicial da matriz, e a evolução do estado bicelle para uma matriz capaz de suportar o crescimento do cristal não foi elucidada.

Esforços consideráveis ​​foram feitos para desenvolver novos métodos, materiais e ferramentas que poderiam ajudar a superar esses obstáculos. No entanto, apesar das tentativas anteriores, a taxa de deposição de estruturas de proteínas de membrana (a primeira estrutura de proteína de membrana foi depositada em 1985) ainda está longe daquelas alcançadas para proteínas solúveis.

Para superar o desafio, um novo método, ou seja, cristalização de MP na matriz de fase cúbica lipídica (LCP), foi introduzido em 199612. Essa abordagem permitiu a cristalização de MPs desafiadoras (por exemplo, rodopsinas13,14,15 e receptores acoplados à proteína G) que resistiram à cristalização com os métodos padrão de difusão de vapor por décadas16,17,18.

A abordagem de cristalização in meso foi desenvolvida e expandida com outros métodos e ferramentas, por exemplo, a utilização de lipídios com propriedades variadas para criar a matriz LCP19, cristalização de nanodiscos baseados em MSP20 ou ligados a polímeros21,22 e cristalização de bicelas7,9 ,10.

Anteriormente, as bicelas foram introduzidas como um modelo de imitação de membrana potencialmente superior às micelas23. Foi demonstrado que algumas misturas de lipídios e detergentes formam partículas em forma de disco, com uma bicamada lipídica, um núcleo e uma borda estabilizada por detergente, proporcionando um ambiente estabilizador para MPs, imitando as membranas celulares nativas. Dimiristoil fosfatidilcolina (DMPC) é frequentemente usado como um componente fosfolipídico de cadeia longa de bicelles, e pode ser dopado com fosfolipídios com comprimentos de cadeia semelhantes, mas grupos de cabeça diferentes. Por outro lado, a borda pode ser estabilizada por um derivado de cadeia curta de sais biliares, como 3-(colamidopropil) dimetilamonio-2-hidroxi-1-propanossulfonato (CHAPSO). Uma vez que o fosfolipídio de cadeia longa em bicelles é sequestrado na região central planar, que é desprovida de fosfolipídio de cadeia curta ou detergente, a região central de um bicelle imita uma seção de membrana natural muito melhor do que as micelas detergentes convencionais. O tamanho e as propriedades dessas partículas lipídicas podem variar em função da proporção de um lipídio de cadeia longa para um detergente ou um lipídio de cadeia curta (Q-ratio) e concentração de lipídios. A variação de Q fornece uma variedade de fases bicelle semelhantes que são passíveis de diferentes tipos de estudos biológicos. Em geral, em uma alta proporção lipídica (Q > 2) e uma ampla faixa de concentração (Clp = 0,25–25% (p/p)), formam-se bicelas com um diâmetro de aproximadamente 100–500 Å24,25,26,27 ,28,29,30,31,32,33. A diminuição de Q resulta em bicelas menores24,34,35,36.