Biossíntese de colesterol modula a diferenciação em células da crista neural craniana murina

Scientific Reports volume 13, Número do artigo: 7073 (2023) Citar este artigo

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As células da crista neural craniana (cNCC) são uma população de células embrionárias multipotentes que dão origem a um conjunto diversificado de tipos de células. Essas células são particularmente vulneráveis a estressores metabólicos externos, como exemplificado pela associação entre hiperglicemia materna e malformações congênitas. Estávamos interessados em estudar o efeito de várias concentrações de glicose e piruvato no metabolismo, migração e diferenciação do cNCC usando um modelo de célula de crista neural murino estabelecido (O9-1). Observamos inesperadamente um padrão de expressão gênica sugestivo de indução da biossíntese de colesterol em condições de depleção de glicose em células O9-1. Além disso, mostramos que o tratamento com dois inibidores diferentes da síntese de colesterol interferiu na migração e diferenciação celular, inibindo a condrogênese enquanto aumentava a diferenciação de células musculares lisas. Como a arrinia congênita (nariz externo ausente), uma malformação causada por mutações no SMCHD1, parece representar, em parte, um defeito no cNCC, também estávamos interessados em investigar os efeitos da disponibilidade de glicose e colesterol na expressão de Smchd1 em células O9-1 . A expressão de Smchd1 foi induzida em condições de alta glicose, enquanto os inibidores da síntese de colesterol diminuíram a expressão de Smchd1 durante a condrogênese. Esses dados destacam um novo papel para a biossíntese do colesterol na fisiologia do cNCC e demonstram que a variabilidade fenotípica humana em portadores da mutação SMCHD1 pode estar relacionada, em parte, à sensibilidade do SMCHD1 à dosagem de glicose ou colesterol durante o desenvolvimento.

As células da crista neural (NCCs) são uma população de células embrionárias transitórias derivadas do ectoderma que dão origem a um conjunto diversificado de tipos de células. Durante o desenvolvimento embrionário, os NCCs em migração atravessam diversos ambientes com nutrientes únicos e ativação localizada de enzimas que podem afetar sua programação genética e fisiologia1. Estudos que examinam o efeito das perturbações na disponibilidade de substrato mostram que a regulação espaço-temporal do desenvolvimento é em parte impulsionada por mudanças no metabolismo2. Alterações metabólicas no NCC estão temporariamente associadas e podem, de fato, estimular etapas críticas na ontogenia do NCC, como proliferação, migração e diferenciação3. Além disso, o NCC parece ser particularmente vulnerável a estressores metabólicos externos, sendo a hiperglicemia um excelente exemplo. O diabetes gestacional está associado a um maior risco de malformações congênitas que afetam os tecidos e órgãos derivados do NCC (por exemplo, sistema cardiovascular, esquelético e nervoso central), sugerindo que a hiperglicemia materna é altamente tóxica para o NCC4,5,6,7. De fato, estudos in vitro iniciais demonstraram que as condições de cultura de alta glicose inibem a proliferação e migração de cNCC de rato devido à superprodução de espécies reativas de oxigênio8. Trabalhos mais recentes em pintinhos mostraram ainda que a exposição a altos níveis de glicose regula positivamente a apoptose e a autofagia mediada por ERK no desenvolvimento de cNCC9 e suprime a diferenciação de células-tronco embrionárias em uma linhagem neuronal10. Não houve estudos, no entanto, para determinar como a disponibilidade de nutrientes afeta a fisiologia do NCC usando a linha celular O9-1, uma linha multipotente derivada de NCCs embrionárias de camundongos11.

Defeitos na ontogenia, migração e/ou diferenciação do NCC dão origem a um conjunto de condições chamadas neurocristopatias. A síndrome de microftalmia de Bosma arhinia (BAMS) é uma malformação congênita grave extremamente rara que parece refletir um defeito primário do NCC12 craniano, células placiformes cranianas13 ou sua interação. A BAMS consiste na tríade clínica de arrinia (ausência do nariz), defeitos oculares e hipogonadismo14 e é causada por mutações no gene Structural Maintenance of Chromosomes Flexible Hinge Domain-containing 1 (SMCHD1)15,16. No entanto, a presença de penetrância incompleta e expressividade variável em famílias multiplex sugere que outros fatores in utero podem influenciar a expressão ou função de SMCHD1. Nossa hipótese é que a disponibilidade de nutrientes poderia ser um desses fatores. O diabetes gestacional não foi relatado em gestações com BAMS, no entanto, é provável que BAMS seja subnotificado (< 100 casos relatados no século passado15), as diretrizes para diagnosticar diabetes gestacional variam de país para país e tornaram-se mais rígidas ao longo do tempo, e recentemente foi foi reconhecido que a hiperglicemia materna está linearmente associada ao risco perinatal sem um limite óbvio17. Assim, usando o sistema modelo O9-1, também investigamos o efeito da disponibilidade de nutrientes na expressão de Smchd1.

0.6). Given that our experimental design included a gradient of glucose concentrations, we then chose to explore the two modules where there was also a linear gradient in expression change from HG to CG to NG to NG2P. Sixteen modules of co-expressed genes under different glucose conditions were identified. In the turquoise module, gene expression decreased across conditions, whereas in the blue module, gene expression increased across conditions (Fig. 1A, B, Supplementary Table S1). Overenrichment analysis of the turquoise model revealed pathways associated with cell cycle and DNA repair (Supplementary Fig. S1), whereas analysis of the blue module unexpectedly revealed cholesterol biosynthesis, sphingolipid, and glycosphingolipid metabolism (Fig. 1C, Supplementary Fig. S1). Glucose and glucose-derived metabolites provide raw materials for cholesterol synthesis and regulate cholesterol biosynthetic enzymes and uptake23. Glucose depletion would therefore be expected to downregulate cholesterol biosynthesis; however, members of the cholesterol biosynthesis pathway including Hmgcr, the rate-limiting enzyme in cholesterol synthesis, and Hmgcs1, which catalyzes the production of 3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA (HMG-CoA)24,25, showed increased expression under NG and NG2P conditions compared to HG (Fig. 1D). Emopamil binding protein (Ebp), which plays a key role in the final stage of cholesterol biosynthesis, was also upregulated in CG vs. HG conditions (Fig. 1D). We next directly measured free cholesterol, esterified cholesterol, and total (i.e., the sum of free plus esterified) cholesterol levels under the various glucose culture conditions. No significant differences were seen in free or total cholesterol, whereas there was lower esterified cholesterol in HG compared with CG, NG, and NG2P conditions (Fig. 2A–C)./p> 0.6. (D) Heatmap of genes involved in cholesterol biosynthesis./p>

80% confluency./p> 1 and Bonferroni-adjusted p < 0.05 were considered differentially expressed./p> 5 in half of the samples. WGCNA was performed using the blockwiseModule utility with with parameter: soft threshold = 22, networkType = "signed", TomType = "signed", deepSplit = 2, minClusterSize = 30, cutTreeDynamic = 0.2522. Modules with a similarity threshold greater than 0.25 were merged. Genes with module membership > 0.6 for the assigned module were selected for pathway analysis with the R gProfileR software package61./p>