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Scientific Reports volume 13, Número do artigo: 6857 (2023) Cite este artigo

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Os vetores virais representam um gargalo na fabricação de terapias celulares. A eletroporação surgiu como uma abordagem para a transfecção não viral de células primárias, mas as abordagens padrão baseadas em cuvetes sofrem de baixo rendimento, otimização difícil e incompatibilidade com a fabricação de células em grande escala. Aqui, apresentamos uma nova plataforma de eletroporação capaz de eletroporação rápida e reprodutível que pode transfectar com eficiência pequenos volumes de células para pesquisa e otimização de processos e escala para volumes necessários para aplicações em terapia celular. Demonstramos a entrega de DNA plasmidial e mRNA para células T humanas primárias com alta eficiência e viabilidade, como eficiência de transfecção > 95% para entrega de mRNA com < 2% de perda de viabilidade celular em comparação com células de controle. Apresentamos métodos para dimensionamento de entrega que atingem uma taxa de transferência experimental de 256 milhões de células/min. Finalmente, demonstramos uma modificação terapeuticamente relevante de células T primárias usando CRISPR/Cas9 para derrubar a expressão do receptor de células T (TCR). Este estudo mostra os recursos do nosso sistema para atender às necessidades não atendidas de engenharia eficiente e não viral de células T para fabricação de células.

As terapias celulares têm gerado entusiasmo pelo seu potencial para tratar uma variedade de doenças hereditárias e adquiridas. Em particular, as imunoterapias que utilizam células T autólogas modificadas para expressar receptores quiméricos de antígenos (CARs) alcançaram taxas notáveis ​​de resposta completa com remissões duráveis ​​e duradouras para certos cânceres hematológicos. A pesquisa está sendo direcionada para o tratamento de outros tipos de câncer, como tumores sólidos. No entanto, a primeira geração de terapias de células CAR-T aprovadas depende de vetores virais, como lentivírus ou vírus adeno-associado (AAV) para reprogramação celular1,2,3,4,5. Os vetores virais permitiram a transdução de alta eficiência de células imunes humanas primárias difíceis de transfectar, mas têm várias desvantagens relacionadas aos seus processos de fabricação complexos e caros, imunogenicidade e potencial para mutagênese insercional6,7,8. Além disso, o campo está tendendo a métodos de reprogramação mais complexos, como edições múltiplas de genes por meio da tecnologia CRISPR/Cas9 e inserção de genes por elementos transposon, que não são compatíveis com limites de empacotamento típicos associados a abordagens virais9,10,11,12,13.

Para contornar essas limitações, os esforços de pesquisa têm se concentrado cada vez mais em métodos de transfecção não viral para substituir a entrega viral9,14,15. Entre os métodos de transfecção não viral, a eletroporação é uma abordagem bem estudada comumente usada para entregar DNA, RNA e proteínas em células que são reconhecidas como uma das principais concorrentes para a substituição de vetores virais. Por exemplo, Bozza et al. demonstraram a capacidade de usar a eletroporação para gerar células T recombinantes usando nanovetores de DNA não integrados que contornam muitas das desvantagens associadas às abordagens virais8. Da mesma forma, a eletroporação foi recentemente usada para gerar células CAR-T através do uso do sistema transposon Sleeping Beauty para o primeiro ensaio clínico com células CAR-T livres de vírus na Europa16, bem como com o sistema piggyBac17.

No método padrão de eletroporação estática que tem sido usado por muitos anos, um campo elétrico é criado pela aplicação de pulsos elétricos de alta voltagem a suspensões de células dentro de uma cubeta18. Os pulsos de alta voltagem aplicados criam poros transitórios na membrana celular que permitem que as moléculas se difundam nas células19,20. No entanto, a força excessiva do campo elétrico pode produzir ruptura irreversível da membrana celular e morte celular. No processo padrão, a voltagem do pulso, o número de pulsos e a duração do pulso estão entre os parâmetros empiricamente variados para otimizar a eficiência da inserção molecular e a sobrevivência celular. A otimização empírica pode ser tediosa e pode haver variabilidade no processo devido, entre outras coisas, à localização aleatória das células em relação aos eletrodos21. Além disso, os métodos padrão de eletroporação em estilo de cubeta têm rendimento limitado, incompatível com a fabricação de células automatizadas ou em grande escala22. Como tal, limitações na eficiência da transferência molecular, viabilidade celular, variabilidade do processo e rendimento limitado limitaram a aplicação generalizada deste método, embora as vantagens potenciais sobre o uso de vetores virais sejam compreendidas.