Amostra microfantasma de dispersão 3D para avaliar a precisão quantitativa em técnicas de microscopia de fase tomográfica

Scientific Reports volume 12, Número do artigo: 19586 (2022) Citar este artigo

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Neste artigo, apresentamos uma estrutura de espalhamento biomimético estruturalmente complexa, fabricada com polimerização de dois fótons, e utilizamos esse objeto para avaliar um sistema de imagem computacional. O fantasma permite adaptar a dispersão modificando seus graus de liberdade, ou seja, contraste do índice de refração e dimensões da camada de dispersão e incorpora um teste de qualidade de imagem 3D, representando uma única célula dentro do tecido. Embora a amostra possa ser usada com várias técnicas de microscopia 3D, demonstramos o impacto da dispersão em três métodos de reconstrução de microscopia de fase tomográfica (TPM). Um desses métodos assume que a amostra é de dispersão fraca, enquanto os outros dois levam em conta a dispersão múltipla. O estudo é realizado em dois comprimentos de onda (visível e infravermelho próximo), que servem como fator de escala para o fenômeno de espalhamento. Descobrimos que alterar o comprimento de onda do visível para o infravermelho próximo afeta a aplicabilidade dos métodos de reconstrução do TPM. Como resultado do espalhamento reduzido na região do infravermelho próximo, as técnicas orientadas para espalhamento múltiplo funcionam de fato pior do que um método voltado para amostras de espalhamento fraco. Isso implica na necessidade de selecionar a abordagem adequada, dependendo das características de dispersão da amostra, mesmo no caso de mudanças sutis na interação objeto-luz.

Um dos desafios modernos em óptica computacional é a imagem de amostras de dispersão com alta resolução1. Isso pode ser atribuído ao fato de que estruturas biológicas complexas, como esferoides ou organoides, tendem a ser modelos mais relevantes do que culturas de células 2D, por exemplo, para descoberta de medicamentos2. Além disso, a maioria das técnicas de imagem in vivo requer que a luz de sondagem passe através da estrutura complexa de um tecido que limita muito as profundidades de imagem devido à dispersão múltipla. Essa demanda estimula o desenvolvimento de novos métodos1,3,4,5, porém é difícil selecionar um adequado com base na força de espalhamento do espécime analisado. Por esta razão, um método versátil, repetível e quantitativo para a avaliação de diferentes sistemas de imagem e algoritmos é essencial para determinar seus limites de aplicabilidade, dependendo das propriedades de dispersão do objeto. Uma possibilidade é usar microfantasmas calibrados como alvos de imagem. Infelizmente, os microfantasmas existentes são tipicamente de dispersão fraca (por exemplo, microesferas de índice correspondente) ou excessivamente simplistas (por exemplo, microesferas de índice incompatível)6,7 em comparação com os tipos de amostras multicelulares de dispersão heterogênea para as quais os métodos de dispersão múltipla se destinam. Esta é uma limitação crítica ao caracterizar métodos de imagem computacional que utilizam solucionadores não convexos, onde a convergência iterativa depende da complexidade da paisagem de energia e está diretamente associada à complexidade 3D de uma amostra8.

Neste trabalho, apresentamos um microfantasma impresso em 3D com distribuição de índice de refração (IR) de dispersão múltipla. Para isso, aproveitamos os desenvolvimentos recentes na impressão 3D via gravação direta a laser9,10,11,12. Entre várias técnicas de impressão 3D disponíveis13,14,15,16,17,18, escolhemos uma polimerização de dois fótons que permite a impressão 3D de amostras microfantasmas com geometria conhecida e IR calibrado. Quando comparado a outras implementações de gravação direta a laser, permite (1) controlar o RI com faixa de modulação relativamente alta, (2) ajustar o contraste do RI ou força de dispersão pós-fabricação usando diferentes líquidos de imersão e (3) manipular e meça o microfantasma da mesma forma que os espécimes biológicos. A seguir, apresentamos a aplicação do fantoma no campo da microscopia tomográfica de fase (TPM), técnica que já demonstrou resultados impressionantes em imagens biológicas em trabalhos anteriores. No entanto, é importante observar que todos os métodos de imagem computacional podem ser avaliados com o procedimento proposto.